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產(chǎn)品中心

Product Center
GST填料
產(chǎn)品簡(jiǎn)介

GST填料可以一步純化各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的谷胱gan肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱gan肽依賴性蛋白和谷胱gan肽轉(zhuǎn)移酶的重組衍生物。 以高度交聯(lián)的4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì),通過12個(gè)原子的間隔臂,用化學(xué)方法共價(jià)結(jié)合了還原型谷胱gan肽制作而 成。Glutathione Beads 4FF因其耐壓的基質(zhì),可以在相對(duì)較高的流速下,實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的純化,更適合用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化。

產(chǎn)品型號(hào):
更新時(shí)間:2026-01-07
廠商性質(zhì):代理商
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品牌其他品牌貨號(hào)G10510
供貨周期現(xiàn)貨計(jì)量單位

Glutathione Beads 4FFGST填料


產(chǎn)品貨號(hào):G10510

產(chǎn)品說明

Glutathione Beads 4FF可以一步純化各種表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的谷胱gan肽-S-轉(zhuǎn)移酶、谷胱gan肽依賴性蛋白和谷胱gan肽轉(zhuǎn)移酶的重組衍生物。 Glutathione Beads 4FF是以高度交聯(lián)的4%瓊脂糖凝膠為基質(zhì),通過12個(gè)原子的間隔臂,用化學(xué)方法共價(jià)結(jié)合了還原型谷胱gan肽制作而 成。Glutathione Beads 4FF因其耐壓的基質(zhì),可以在相對(duì)較高的流速下,實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的純化,更適合用于工業(yè)大規(guī)模蛋白的純化。

1 Glutathione Beads 4FF 產(chǎn)品性能



項(xiàng)目

性能

基質(zhì)

高度交聯(lián)的4%瓊脂糖凝膠

配體

通過12原子間隔臂偶連的谷胱gan肽

載量

>10 mg GST-tagged protein(40 kDa) /ml 介質(zhì)

微球粒徑

45-165 pm

最da壓力

0.3 MPa, 3 bar

pH穩(wěn)定范圍

3-12

儲(chǔ)存緩沖液

20%乙醇的1xPBS

儲(chǔ)存溫度

2-8 °C

純化流程

1. 緩沖液的準(zhǔn)備

緩沖液在使用前最hao用0.22um或者0.45um濾膜過濾。

平衡/洗雜液:140 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH 7.4

洗脫液:用平衡液配制10mM還原型谷胱gan肽(現(xiàn)配現(xiàn)用)

注意:平衡液和洗脫液中可加入1-10 mM DTT

2. 樣品準(zhǔn)備

樣品在上樣前建議離心或用0.22um或0.45um濾膜過濾,減少雜質(zhì),提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

2.1細(xì)菌或酵母表達(dá)的蛋白

1)挑取單菌落到培養(yǎng)基中,根據(jù)載體使用說明,加入相應(yīng)濃度的誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)相應(yīng)的時(shí)間。

2)表達(dá)結(jié)束后,將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心杯中,7000 rpm(7500xg),離心15 min收集菌體,然后按照菌體:平衡液=1: 10(W/V)加入平衡液,加入終濃度為1 mM的PMSF。加入溶jun酶(工作濃度為0.2-0.4 mg/ml,如果表達(dá)的宿主細(xì)胞內(nèi)含pLysS或pLysE,可以不加溶jun酶,同時(shí)也可加入其他蛋白酶抑制劑,但不能影響目的蛋白與填料的結(jié)合)。

3)將菌體沉淀懸浮起來,(如果菌液濃度高,也可考慮加入10 ug/ml RNase A和5 ug/ml DNase I),混勻,放置于冰上,然后冰上超聲破碎細(xì)胞,至菌液基本保持澄清。

4)將澄清的破碎液轉(zhuǎn)移至離心管中,10000 rpm(15000xg), 4°C離心20-30 min。取上清,置于冰上備用或-20°C保存。

2.2酵母、昆蟲和哺乳細(xì)胞分泌表達(dá)可溶性蛋白

1) 將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至離心杯,5000 rpm(3800xg),離心10 min,收集菌體得上清,即可直接加入柱子使用。

2) 對(duì)于大量體積的上清,需加入硫酸銨沉淀濃縮后,蛋白還需用平衡液透析后才能加入柱子。

3. 層析柱的裝填

3.1重力柱的裝填

1)取合適規(guī)格的重力層析柱,裝入下墊片,加入適量純水潤(rùn)洗柱管和墊片,關(guān)閉下出口。

2)將Glutathione Beads 4FF混合均勻,用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中(介質(zhì)實(shí)際體積占懸液的一半),打開下出口流干保護(hù)液。

3)加入適量純水沖洗介質(zhì),待柱管中液體重力流干后,關(guān)閉下出口。

4)裝入潤(rùn)洗后的上墊片,確保墊片與填料之前沒有空隙,且保持水平。

5)裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進(jìn)行平衡,暫不使用時(shí)則加入保護(hù)液,2-8°C保存。

3.2中壓層析柱的裝填

裝柱前根據(jù)層析柱直徑計(jì)算柱子底面積,根據(jù)所需裝柱高度計(jì)算所需介質(zhì)體積,公式如下:

V = 1.15πr2h  (V:所需介質(zhì)體積ml;1.15:壓縮系數(shù);r:柱管半徑cm;h:裝填高度cm)

注意:所取懸液體積應(yīng)為介質(zhì)體積的兩倍,因?yàn)榻橘|(zhì)體積只占懸液總體積的一半,另一半為保護(hù)液。

1)用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭,確保柱底篩板上無氣泡,關(guān)閉柱底出口,并在柱底部留1-2 cm的去離子水。

2)將介質(zhì)懸浮起來,小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生。

3)如果使用儲(chǔ)液器,應(yīng)立即在層析柱和儲(chǔ)液器中加滿水,將進(jìn)樣分配器放置于漿液表面,連接至泵上,避免在分配器或進(jìn)樣管中產(chǎn)生氣泡。

4)打開層析柱底部出口,開啟泵,使其在設(shè)定的流速下進(jìn)行。最初應(yīng)讓緩沖液緩慢流過層析柱,然后緩慢增加至最終流速,這樣可避免液壓對(duì)所形成柱床的沖擊,也可以避免柱床形成的不均勻。如果達(dá)不到推薦的壓力或流速,可以用所使用泵的最da流速,這樣也可以得到一個(gè)很好的裝填效果。(注意:在隨后的色譜程序中,不要超過最da裝柱流速的75%)當(dāng)柱床高度穩(wěn)定后,在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水。標(biāo)上柱床高度。

5)關(guān)閉泵,關(guān)閉層析柱出口。

6)如果使用儲(chǔ)液器,去除儲(chǔ)液器,將分配器置于層析柱中。

7)將分配器推向柱子至標(biāo)記的柱床高度處。允許裝柱液進(jìn)入分配器,鎖緊分配器接頭。

8)將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中,開始平衡。如果需要可以重新調(diào)整分配器。

4. 樣品純化流程

4.1孵育法純化

1)根據(jù)純化樣品量,取適量Glutathione Beads 4FF加入離心管中,1000rpm離心1 min,吸棄上清;也可加入重力柱中,流干保護(hù)液。

2)向離心管中加入5倍介質(zhì)體積的平衡液清洗介質(zhì),1000rpm離心1 min,吸棄上清;如使用重力柱,則直接在重力柱中清洗,直接重力流干平衡液;重復(fù)兩次以上。

3)加入樣品,封閉離心管或重力柱管,4°C振蕩孵育2-4h或者37°C孵育30 min-2h。

4)孵育結(jié)束后,1000 rpm離心1 min,吸棄上清,或過濾收集介質(zhì),上清保留作為流穿,用于電泳鑒定。

5)用5倍介質(zhì)體積的洗雜液清洗介質(zhì),1000 rpm離心1 min或重力柱管過濾,去除上清(注意不要吸到介質(zhì)),重復(fù)3-5次,中間建議更換新離心管。

6)加入3-5倍柱體積的洗脫液進(jìn)行洗脫,室溫孵育10-15 min, 1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液,可重復(fù)2-3次。

4.2重力柱法純化

1)將裝填好的Glutathione Beads 4FF重力柱用5倍柱體積平衡液進(jìn)行平衡,使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下,重復(fù)2-3次。

2)將樣品加到平衡好的重力柱中,樣品保留時(shí)間至少2 min,保證樣品和介質(zhì)充分接觸,收集流出液,可以反復(fù)上樣增加結(jié)合效率。

3)用10-15倍柱體積的洗雜液進(jìn)行洗雜,去除非特異性吸附的雜蛋白,收集洗雜液。

4)使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫,分段收集,每一個(gè)柱體積收集一管,分別檢測(cè),既可以保證所有結(jié)合的目的蛋白被洗脫,又可以得 到高純度和高濃度的蛋白。

4.3中壓層析柱法純化

Glutathione Beads 4FF裝填好后,可以用各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。

1)將泵管道中注滿去離子水。去掉上塞子,將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中,打開下出口,將預(yù)裝柱接到色譜系統(tǒng)中,并旋緊。

2)用3-5倍柱體積的去離子水沖洗出儲(chǔ)存緩沖液。

3)使用至少5倍柱床體積的平衡液平衡色譜柱。

4)利用泵或樣品環(huán)上樣。

:樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少,也會(huì)導(dǎo)致層析柱很大的反壓。上樣量不要超過柱子的結(jié)合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓,使得進(jìn)樣器更難使用。

5)用洗雜液沖洗柱子,直到紫外吸收達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定的基線(一般至少10-15個(gè)柱體積)。

6)使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫,收集洗脫液,即目的蛋白組分。

上述步驟洗脫結(jié)束后,用平衡液沖洗3倍柱體積,然后用純水沖洗5倍柱體積,再用保護(hù)液沖洗2個(gè)柱體積,然后將介質(zhì)置于2-8°C保存。

5. SDS-PAGE 檢測(cè)

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品(包括流出組分、洗雜組分和洗脫組分)以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。

6. 填料清洗

GST標(biāo)簽蛋白純化產(chǎn)品可以重復(fù)使用而無需再生,但隨著非特異性結(jié)合的蛋白的增多和蛋白的聚集,往往造成流速和結(jié)合載量性能下降, 這時(shí)需要對(duì)填料進(jìn)行清洗。

去除一些沉淀或變性物質(zhì),建議使用下面的方法

2倍柱體積的6 M鹽酸胍溶液進(jìn)行清洗,然后立即用5倍柱體積的PBS, pH 7.4清洗。

去除一些疏水性吸附造成的非特異性吸附物質(zhì)

3-4倍柱體積的70%乙醇或2倍柱體積的1% Triton X-100清洗,然后立即用5倍柱體積的PBS, pH 7.4清洗。



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