Annexin V-PE/RedNucleus Ⅱ細(xì)胞凋亡試劑盒

貨號：AF2022

儲存條件:4℃避光冷藏，請勿凍存。Annexin V-PE 儲存于 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1% BSA, 0.02% NaN3, pH 7.4 的溶液中。

光譜特性

Annexin V-PE：Ex/Em=488/578 nm RedNucleus II：Ex/Em=635/695 nm

產(chǎn)品介紹

Annexin V 是一類廣泛分布于真核細(xì)胞胞漿的鈣離子依賴性的磷脂結(jié)合蛋白。Annexin V 則選擇性的結(jié)合磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS），PS 在細(xì)胞正常狀態(tài)下是分布于細(xì)胞磷脂層內(nèi)側(cè)，即靠近細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞處于早期凋亡階段，PS 會從細(xì)胞內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞外側(cè)，此時 Annexin V 可以與 PS 結(jié)合，被紅色熒光染料 PE 標(biāo)記的 Annexin V 作為探針則會在一定波長激發(fā)的情況下檢測出處于早期凋亡狀態(tài)的細(xì)胞。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞完整性已經(jīng)被破壞， Annexin V-PE 則可以進(jìn)入胞漿與處于磷脂層內(nèi)側(cè)的 PS 結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。

本試劑盒中提供的 RedNucleus II 是一種遠(yuǎn)紅光染料， 屬于蒽醌類化合物，不能透過活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，是非滲透性的，但是可以快速染色死亡和透化細(xì)胞中的細(xì)胞核/dsDNA。RedNucleus II 是一種理想的碘化丙啶( PI )和7-AAD的替代物，與 PE聯(lián)用，無需補(bǔ)償調(diào)節(jié)，具有更好的光譜特性：不受紫外線的激發(fā)，也不與 PE/PE 同系物重疊發(fā)射，故可以和 FITC，PE 及紫色熒光染料結(jié)合用于多色分析。與 Annexin V-PE 聯(lián)用時，RedNucleus II 被排除在活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞外，而晚期凋亡細(xì)胞和死細(xì)胞則同時被 Annexin V-PE 和 RedNucleus II 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性。

Annexin V-PE/RedNucleus II 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒可用流式細(xì)胞儀及或其他熒光檢測設(shè)備進(jìn)行檢測。

使用方法

1. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。檢測樣品中應(yīng)包含未經(jīng)處理的細(xì)胞樣品，作為陰性對照。

2. 沉淀細(xì)胞：對于懸浮細(xì)胞：1000 rpm，離心 5 min。對于貼壁細(xì)胞：用不含 EDTA 的胰酶消化后 1000 rpm，離心 5 min。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞無法*離心至管底，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50 μL 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。

注：用胰蛋白酶消化然后使細(xì)胞在最hao細(xì)胞培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基中恢復(fù)約 30 min，然后再染色。胰蛋白酶消化會暫時破壞質(zhì)膜，允許 Annexin V 結(jié)合磷脂酰絲氨酸在細(xì)胞膜的細(xì)胞質(zhì)表面上，從而導(dǎo)致假陽性染色。

3. 加入約 1 mL 4℃預(yù)冷的 PBS，重懸細(xì)胞，1000 rpm，離心 5 min。

4. 重復(fù)步驟 3。

5. 用 1×Annexin V 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為1-5×106 細(xì)胞/mL。  

6.取100 μL的細(xì)胞懸液于5 mL流式管中， 加入5 μL Annexin V-PE、5 μL RedNucleus II，混勻后于室溫避光孵育15-20 min。

7.（可選步驟）準(zhǔn)備兩管額外的凋亡細(xì)胞，每管中只加入一種單染染料（Annexin V-PE 或 RedNucleus II），用于流式單染的補(bǔ)償調(diào)節(jié)）。

8. 加入 400 μL 1× Annexin V 結(jié)合緩沖液，混勻，進(jìn)行流式檢測，Annexin V-PE 由 488 nm 激光激發(fā)，檢測熒光發(fā)射光譜在 578 nm 處（FL2 或 BL2 通道），RedNucleus II 由 638 nm激發(fā)，選擇 FL4 或RL1 通道檢測。

注意事項(xiàng)

1.熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2.為了避免洗滌細(xì)胞時損失細(xì)胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的 Tip 頭吸液。

3.為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。