貨號：CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

存儲條件：4oC保存

產(chǎn)品說明

CHIP檢測試劑盒用于通過免疫沉淀來沉淀和目標蛋白結(jié)合的染色質(zhì)片段，最后通過PCR或Southern等方法來檢測沉淀的染色質(zhì)片段的試劑盒。通常用于檢測特定的轉(zhuǎn)錄因子或組蛋白等基因組DNA結(jié)合蛋白是否和預期的特定基因組DNA序列在同一復合物中。通過ChIP檢測可以獲得在體的(In Vivo)目標蛋白和預期基因組DNA片段是否在同一復合物中的結(jié)論。ChIP的檢測結(jié)果則可明確說明這種結(jié)合在細胞內(nèi)是真實發(fā)生的。

本ChIP檢測試劑盒采用HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Magnetic beads作為CHIP下拉的珠子，具有載量高結(jié)合力強、省時高效的特點。試劑盒提供預混合的對照引物 (Control Primers) ，可用于擴增 human GAPDH的部分相應序列，引物序列為：5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’； 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

操作步驟（僅供參考）：

一、樣品超聲處理條件的優(yōu)化：

1. 準備適量預冷的PBS，以及100mM PMSF。將SDS Lysis Buffer適當溫浴使其中的SDS充分溶解，并混勻。

2. 將細胞培養(yǎng)于250px細胞培養(yǎng)皿中，細胞培養(yǎng)液的用量為10 ml。在預期發(fā)生目的蛋白和基因組DNA結(jié)合的時間直接向細胞培養(yǎng)液中加入適量甲醛，輕輕混勻，至最終濃度為1%。然后在37oC孵育10分鐘，以交聯(lián)目的蛋白和相應的基因組 DNA。例：250px細胞培養(yǎng)皿中加入10ml細胞培養(yǎng)液的情況下需加入270ul 37%甲醛。請注意盡量使用高質(zhì)量、有效使用期限內(nèi)的甲醛。細胞也可以培養(yǎng)于150px細胞培養(yǎng)皿中，相關溶液的用量需按照比例進行調(diào)整。

3. 加入1.1ml Glycine Solution (10X)，輕輕混勻。室溫放置5分鐘。

4. 將有細胞樣品的培養(yǎng)皿置于冰浴上。吸出含甲醛和glycine的培養(yǎng)液，盡量保持沒有液體殘留。

5. 室溫放置5分鐘，期間用預冷的PBS稀釋100mM PMSF至1mM，即配制成冰浴預冷的含1mM PMSF的PBS。 PMSF水性溶液一定要新鮮配制，其在水相中的半衰期約為30min。

6. 加入5-10ml預冷的PBS（含1mM PMSF），洗滌細胞，吸盡液體，盡量保持沒有液體殘留。

7. 再加入5-10ml預冷的PBS（含1mM PMSF），進一步洗滌細胞，吸盡液體，盡量保持沒有液體殘留。

8. 加入1ml預冷的PBS（含1mM PMSF），用細胞刮子刮下細胞，收集至離心管中。如細胞可以用槍吹打下來，也可以用槍吹打。對細胞進行計數(shù)，分裝成每管大約100萬細胞。

9. 4oC，800-1000g離心1-2分鐘，充分沉淀細胞。如果發(fā)現(xiàn)沉淀不充分，可以適當延長離心時間。吸盡上清，盡量減少液體殘留。

10. 配制適量含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer。上步驟的100萬細胞沉淀用0.2ml含有1mM PMSF的SDS Lysis Buffer重懸。

11. 在冰浴上孵育10分鐘，以充分裂解細胞。

12. 超聲處理，以剪切基因組DNA，使DNA大部分斷裂成200-1000bp大小，如能將大部分片段控制在400-800bp則更佳。超聲過程中請注意要保持樣品處于冰浴中保持較低溫度。超聲剪切的效果在后續(xù)去交聯(lián)后可以用常規(guī)的DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測。超聲處理的條件通?？稍O置為10秒每次，共3-4次，功率為50W時設置為最大功率的30%，采用2mm超聲頭。

不同的超聲處理儀器的設置不太一樣，摸索超聲條件時，可以先固定其他條件，先確定每次超聲多長時間不會導致明顯發(fā)熱，再摸索不同的超聲次數(shù)。直至找到比較合適的超聲次數(shù)可使大部分基因組DNA斷裂成200-1000bp大小。需注意每次的超聲體積和細胞用量宜固定，否則就不能使用一個相對比較固定的超聲條件用于后續(xù)實驗。   

注：在對超聲后基因組DNA大小進行檢測時，如果采用瓊脂糖凝膠點染法（即將核酸染料添加到loading buffer中的方式）或者膠染法，由于電泳時SDS會與此類染料結(jié)合形成異常條帶，條帶通常在500-1000bp左右，因此會對超聲后基因組DNA大小的判斷造成一定的影響。建議采用后染法進行條帶大小的檢測，使用該方法不會有異常條帶出現(xiàn)，不影響對超聲后基因組DNA大小的判斷，而且條帶大小更準確。

13. 在0.2ml經(jīng)過超聲處理的樣品中加入8ul 5M NaCl，混勻。65oC加熱4小時，以去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。

14. 加入等體積的Tris平衡苯fen，vortex劇烈混勻，隨后4oC，12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。

15. 加入等體積氯仿，vortex劇烈混勻，隨后4oC，12000g左右離心5min。吸取上清至另一離心管中。

注： 上述步驟14和15的酚氯仿抽提可以使用DNA純化試劑盒進行操作。

16. 取少量通過酚氯仿抽提或DNA純化試劑盒獲得的液體，對于酚氯仿抽提產(chǎn)物可以取5-10ul，對于DNA純化試劑盒純化產(chǎn)物可以取2-5ul，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察超聲處理對于基因組DNA的剪切效果。

二、染色質(zhì)免疫沉淀：

1. 在對樣品超聲處理條件進行優(yōu)化后，對于待檢測樣品按照樣品超聲處理條件的優(yōu)化中1-11的步驟進行操作，并參考步驟12進行超聲處理。

2. 對于經(jīng)過超聲處理的樣品在4oC，12000-14000g離心5min。取上清(約0.2ml)至2ml離心管中，置于冰浴。

3. 配制適量含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer。加入1.8ml含有1mM PMSF的ChIP Dilution Buffer以稀釋經(jīng)過超聲處理的樣品，使最終體積為2ml。

4. 取出20ul樣品作為Input用于后續(xù)檢測。取 20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Magnetic beads添加PBS或者TBST溶液至500ul進行吹打清洗，置于磁力架上用移液器小心洗掉上清，重復清洗2-3次（為更好的減少非特異性1也可以用1-5% BSA 或 脫脂牛奶 預處理Beads 1小時） 。

5. 將清洗或者封閉好的20ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-Magnetic beads加入步驟3剩余的樣品中，同時可用無細胞樣品的溶液作為空白對照，以及不加beads樣品作為陰性對照，或用無關的抗體作為陰性對照。在4oC緩慢轉(zhuǎn)動或擺動混勻30- 60min，以沉淀目的蛋白或相應的復合物。

6. 將以上含有樣本的離心管置于磁力架上10s。非常小心地去除上清，切勿觸及沉淀。隨后依次用如下溶液對沉淀進行洗滌，每次洗滌液的用量為1ml，每次在4oC緩慢轉(zhuǎn)動或擺動洗滌3-5min，隨后置于磁力架上10s。小心去除上清液體，切勿觸及沉淀。

(a) Low Salt Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。

(b) High Salt Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。 

(c) LiCl Immune Complex Wash Buffer洗滌一次。

(d) TE Buffer洗滌兩次。

注： 完成上述所有洗滌步驟后所獲得的沉淀即可用于PCR擴增目的基因序列或用Southern檢測目的基因序列， 或者用于Western檢測等。

三、PCR擴增目的基因序列(如ChIP產(chǎn)物用于檢測目的基因序列)：

1. 新鮮配制適量Elution buffer (1% SDS, 0.1M NaHCO3)。

2. 完成步驟免疫沉淀步驟第7步后，即完成所有洗滌步驟后，加入250ul Elution buffer。Vortex混勻，室溫轉(zhuǎn)動或擺動繼續(xù)洗脫3-5min。

3. 置于磁力架上分離 10 秒，將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中。沉淀中再加入250ul Elution buffer。Vortex混勻，室溫轉(zhuǎn)動或擺動繼續(xù)洗脫3-5min。

4. 置于磁力架上分離 10 秒，取出上清。和上一步驟即步驟3中獲得的上清合并。共計約500ul上清。

5. 在500ul上清中加入20ul 5M NaCl，混勻。65oC加熱4小時，以去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。對于步驟2D獲得的作為Input的20ul樣品，加入1ul 5M NaCl，混勻，65oC加熱4小時，同樣用于去除蛋白和基因組DNA之間的交聯(lián)。此步驟完成后可以繼續(xù)進行后續(xù)步驟，也可先-20oC凍存，第二天繼續(xù)后續(xù)步驟。

注1：此時的樣品已經(jīng)可以用于PCR，可以嘗試使用1、2、5或10ul樣品作為模板用于PCR檢測目的基因。此時PCR的效果和可能被沉淀下來的DNA的量，以及整個PCR擴增體系是否容易擴增目的基因有關。如果發(fā)現(xiàn)PCR效果欠佳，可以考慮通過后續(xù)的純化步驟，純化并濃縮樣品再進行PCR檢測。

注2：通常情況下，推薦進行后續(xù)純化后再進行PCR檢測，Input一般無需進行后續(xù)純化步驟。

6. 在約520ul樣品中加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris pH 6.5和1ul 20mg/ml 蛋白酶K。混勻后45oC孵育60分鐘。

7. 加入等體積Tris平衡苯fen，vortex劇烈混勻，隨后4oC，12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。

8. 加入等體積氯仿，vortex劇烈混勻，隨后4oC，12000g左右離心5分鐘。吸取上清至另一離心管中。

9. 加入20ug glycogen或yeast tRNA，加入1/10體積的3M NaAc，pH5.2，再加入2.5倍體積無水乙醇?；靹蚝?70oC沉淀不少于1小時，或-20oC沉淀8小時以上。

10. 4oC，12000-14000g離心10分鐘，小心吸去大部分上清，切勿觸及沉淀。

11. 加入約1ml 70%乙醇洗滌沉淀。4oC，12000-14000g離心10min，小心吸去大部分上清，切勿接觸沉淀。

12. 4oC，12000-14000g離心1min，小心吸除殘留液體。

13. 用少量TE或水重懸DNA沉淀，用于目的基因的PCR檢測。用于PCR的引物最好能設計2組，可以用Input作為模板預先摸索出相應的PCR條件，并選擇一組效果較好的引物用于最終的PCR檢測。少數(shù)情況下，當PCR條帶過弱時，可以采用nested PCR技術，進行兩輪擴增。

注：步驟7至步驟13也可采用適當?shù)腄NA純化試劑盒純化DNA。

四、 Western檢測ChIP產(chǎn)物(如果ChIP產(chǎn)物用于Western檢測)：

1. 接步驟染色質(zhì)免疫沉淀第8步，在完成所有的洗滌步驟后，加入25ul SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(1X)。SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(1X)可以用SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5X)用水稀釋配制而成。沸水浴煮沸10分鐘。

2. 取10-20ul用于Western檢測。

注意事項：

1、需自備用于ChIP的一抗，37%甲醛，PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)，蛋白酶K，Glycogen或tRNA，Tris平衡苯fen，氯仿，95%乙醇，70%乙醇，3M NaAc (pH5.2)以及磁力架、細胞刮子或細胞鏟子。

2、需自備超聲樣品處理儀(sonicator)，也稱超聲粉碎機或超聲細胞粉碎機。

3、使用甲醛時請在通風櫥中進行操作。

4、本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

6、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。